藥品中的殘留溶劑是指在合成原料、輔料或制劑生產(chǎn)過程中使用或產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化學(xué)物質(zhì)。他們?cè)谏a(chǎn)過程中未能被全部清除,服用后對(duì)人體有毒性和致癌作用,近年來日益引起各方面的重視,在新藥研究中要求越來越嚴(yán)格。我國在1995年藥典也規(guī)定7種限制溶劑殘留項(xiàng),在2000年藥典中,根據(jù)ICH的限度要求對(duì)這7種溶劑殘留進(jìn)行調(diào)整。ICH要求檢測(cè)的溶劑就有69種,雖然我國藥典并未要求按ICH的規(guī)定實(shí)施,但在新藥研究中對(duì)于殘留溶劑的要求事實(shí)上是參照ICH的規(guī)定執(zhí)行的。這是SDA對(duì)新藥研究從嚴(yán)從高要求的體現(xiàn),也是與國際接軌,適應(yīng)WTO規(guī)則的需要。在實(shí)際工作中,藥品的合成、制劑、消毒工作涉及到的有機(jī)溶劑有上百種,(氣相色譜儀)氣相色譜法是中國藥典對(duì)有機(jī)殘留溶劑測(cè)定的法定檢測(cè)方法,也是檢測(cè)有機(jī)溶劑的、的方法之一.

　　1、(氣相色譜儀)氣相色譜法

　　1.1樣品的處理

　　一般是將樣品溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲?能達(dá)到的濃度越高越好,以利于殘留量極微溶劑的測(cè)定。由于樣品復(fù)雜多樣,為提高樣品濃度,所用溶劑也是多種多樣。一般常用溶劑為水、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO),也有用四氯化碳4、二甲基乙酰胺、乙醇5、正己烷、二氧六環(huán)、乙酸、甲氧基乙醇6、氫氧化鈉溶液7、十二烷基磺酸鈉溶液8等的,不一而足。大部分為單獨(dú)使用,也有的混合使用,主要目的就是增加樣品溶解度。所用溶劑與所測(cè)溶劑應(yīng)達(dá)到較好的分離。其中二甲基甲酰胺、二甲亞砜因其溶解范圍廣,溶解性好,素有“能溶劑”之稱,是的溶劑。需要注意的是,樣品一定要溶清,保證所測(cè)組分都溶解在溶劑中。在一段時(shí)間里,曾將不溶性樣品用水等溶劑超聲提取、離心,取上清液進(jìn)樣,后來發(fā)現(xiàn)這樣不能提取,影響測(cè)定結(jié)果,不盡合理。所以在后來的新藥報(bào)批中均要求將樣品溶清后進(jìn)樣,這在溶劑殘留測(cè)定中是一大發(fā)現(xiàn)和進(jìn)步。直接進(jìn)樣的樣品取一定量溶液進(jìn)樣測(cè)定即可,頂空進(jìn)料的樣品需要在進(jìn)樣前保溫一定時(shí)間,使氣液或氣固兩相達(dá)到分配平衡,然后再進(jìn)行測(cè)定。

　　對(duì)于液體樣品來說,可以將對(duì)照品定量加入到樣品中制成對(duì)照品溶液,與樣品溶液同時(shí)進(jìn)樣,要求樣品溶液的殘留溶劑峰面積的兩倍不得超過對(duì)照峰面積。蔣海松、關(guān)大衛(wèi)用此法測(cè)定壬苯醇醚中二惡烷的殘留量11,何培孝、樊慶銀測(cè)定壬苯醇醚中二氧六環(huán)的12,結(jié)果與部頒標(biāo)準(zhǔn)一致,相比而言方法更加簡便、準(zhǔn)確、可靠。有的樣品需要經(jīng)過萃取、吹掃-捕集等富集,濃縮方法處理,使待測(cè)組分達(dá)到一定的濃度后再進(jìn)樣測(cè)定,可以使結(jié)果更準(zhǔn)確,一般用于微量殘留溶劑或限度要求較高的溶劑如苯的測(cè)定。蔡春、關(guān)景華用吹掃-捕集方法13,測(cè)定硬膏劑中甲苯殘留量。具有自動(dòng)化程度高,回收率好等優(yōu)點(diǎn)。陳曉莉在吉非羅齊中殘留醚化物及其它雜質(zhì)的定量分析中,先將樣品溶解于氫氧化鈉溶液中,再用正己烷提取,取得滿意的結(jié)果14。

　　1.2定量方法

　　用色譜峰定量的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分為四種15,分別為面積歸一化法、標(biāo)準(zhǔn)物添加法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法。前兩種方法很少見到,一般用后兩種方法。中國藥典2000年版規(guī)定兩種方法均可,美國藥典24版(US2PXXIV)16、英國藥典2000年版(BP2000)17均要求用外標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法不要求所有組分都分離、流出和檢測(cè)出來。它只需將要分析的峰與內(nèi)標(biāo)物分離即可。內(nèi)標(biāo)物必須符合下列要求:在樣品中原來沒有內(nèi)標(biāo)物的存在;內(nèi)標(biāo)物必須與所有樣品組分分離;內(nèi)標(biāo)物的流出時(shí)間應(yīng)盡量接近待分析組分;內(nèi)標(biāo)物應(yīng)與待分離的物質(zhì)具有相近的濃度、物化特性和檢測(cè)器的響應(yīng)值;內(nèi)標(biāo)物必需穩(wěn)定、不起化學(xué)反應(yīng)、純度高、揮發(fā)性應(yīng)很低以允許長期保存并且在注樣過程中損失小。待測(cè)樣品可以是一個(gè)或一個(gè)以上。本方法可以消除儀器與操作造成的誤差。外標(biāo)法是用待測(cè)組分的峰面積和峰高與一系列已知的(或外加的)標(biāo)準(zhǔn)樣相比較。標(biāo)準(zhǔn)濃度與待測(cè)組分濃度的濃度量級(jí)應(yīng)相同。樣品與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣濃度與色譜條件應(yīng)完致,標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍應(yīng)包括全部樣品中待測(cè)溶劑的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)由同樣體積的標(biāo)準(zhǔn)物作出。一般適用于進(jìn)樣重復(fù)性較好的樣品。

　　1.3進(jìn)樣方式

　　氣相色譜法的進(jìn)樣方式一般分頂空進(jìn)樣和直接進(jìn)樣兩種。頂空進(jìn)樣又分為溶液頂空和固體頂空。前者就是將樣品溶解于適當(dāng)溶劑中,置頂空瓶中保溫一定時(shí)間,使殘留溶劑在兩相中達(dá)到氣液平衡,定量取氣體進(jìn)樣測(cè)定。固體頂空就是直接將固體樣品置頂空瓶中,置一定溫度下保溫一定時(shí)間,使殘留溶劑在兩相中達(dá)到氣固平衡,定量取氣體進(jìn)樣測(cè)定。在文獻(xiàn)報(bào)道中,溶液頂空應(yīng)用較多,而固體頂空應(yīng)用較少。一般進(jìn)樣體積2mL以下。近年來頂空進(jìn)樣法的應(yīng)用越來越多,其優(yōu)點(diǎn)是可以使殘留溶劑氣化后進(jìn)樣,濃度與溶液相比有很大增加。進(jìn)樣室在較低溫度下操作,可避免組分分解。頂空進(jìn)樣也可大大減少溶解樣品的溶劑和樣品本身對(duì)色譜系統(tǒng)帶來的干擾和污染,縮短分析時(shí)間,增加柱子壽命,而且提高樣品的重現(xiàn)性18。但是頂空進(jìn)樣只對(duì)那些蒸汽壓足夠高以至他們?cè)陧斂罩械臐舛却蟮阶阋允箼z測(cè)器有響應(yīng)的物質(zhì)才能產(chǎn)生色譜峰。加大進(jìn)樣量雖可以增加較不揮發(fā)物質(zhì)的量,但會(huì)帶來峰變寬或重疊、分離度變差等問題,所以一般只應(yīng)用于沸點(diǎn)100℃以下的低沸點(diǎn)溶劑19。另外,一般頂空進(jìn)樣都需要采用自動(dòng)的頂空進(jìn)樣器,費(fèi)用昂貴,成本較高。董英、戰(zhàn)祥友自制頂空裝置20,頂空法測(cè)定膽紅素中乙醇和氯仿的殘留量,孟德賢、郭向勇用自制的頂空瓶測(cè)定合成藥佐匹克隆中的殘留溶劑21,測(cè)定結(jié)果滿意,可以借鑒。呂志華等分別用溶液頂空和固體頂空的方法比較22,測(cè)定幾丁糖酯中的乙醇、丙酮的溶劑殘留量,兩種方法測(cè)定結(jié)果一致,經(jīng)顯著性檢驗(yàn)無顯著差別。在本試驗(yàn)中頂空進(jìn)樣法檢測(cè)限低,精密度高,主要是因?yàn)橐运疄槿軇┻M(jìn)行的頂空進(jìn)樣受平衡溫度波動(dòng)的影響較大。王偉、韓光智用氣固頂空法測(cè)定伊索拉啶中乙醇的殘留量,方法可靠準(zhǔn)確23。固體頂空不受樣品溶解度影響,適合蒸汽壓高、沸點(diǎn)低、含量低的殘留溶劑且不易溶解的樣品。在用毛細(xì)管柱時(shí),一般又選擇分流法進(jìn)樣。分流法是指在氣化室出口分兩路,絕大部分放空,極小部分進(jìn)柱子。這兩部分比例叫分流比。又分為動(dòng)態(tài)進(jìn)樣和靜態(tài)進(jìn)樣,一般應(yīng)用較多的是動(dòng)態(tài)進(jìn)樣24。溶液直接進(jìn)樣是指將樣品定量溶解于適當(dāng)溶劑中,準(zhǔn)確量取適量注入氣相色譜儀測(cè)定溶劑殘留量的進(jìn)樣方法。進(jìn)樣體積一般為2μL以下。本法為通常采用的方法,適用于受熱不易分解的樣品,約占發(fā)表文章總數(shù)的四分之三。溶液直接進(jìn)樣的方法進(jìn)樣量大,可以彌補(bǔ)檢測(cè)器靈敏度的不足,操作也簡便易行。大的缺點(diǎn)是污染進(jìn)樣口和色譜柱,需要及時(shí)清洗。另外由于進(jìn)樣量大,除溶劑峰響應(yīng)值大,分析時(shí)間較長外,還有各種分解產(chǎn)物和溶劑雜質(zhì)峰干擾測(cè)定。一般需選用程序升溫快速除去溶劑并選用純度較高的溶劑。但在毛細(xì)管柱的應(yīng)用中,本方法的長期使用有可能堵塞毛細(xì)管柱口而使色譜柱無法正常使用。

　　1.4色譜柱的選擇

　　氣相色譜柱是樣品中殘留溶劑測(cè)定的理論與物質(zhì)基礎(chǔ),所以對(duì)色譜柱的選擇也是關(guān)鍵的步驟。氣相色譜柱可分為填充柱和毛細(xì)管柱兩大類,其中填充柱又分玻璃柱和不銹鋼柱;毛細(xì)管柱按柱__口直徑一般又有0153mm和0132mm兩種規(guī)格,前者又叫大口徑毛細(xì)管柱,柱容量大,在殘留溶劑測(cè)定中應(yīng)用較多。由于毛細(xì)管柱造價(jià)高,中國藥典2000年版結(jié)合中國國情,用填充柱測(cè)定,美國藥典24版(USPXXIV)和英國藥典2000年版(BP2000)要求用毛細(xì)管柱。從填料來分,填充柱一般選用高分子多孔小球系列(GDX101,GDX102,GDX103,GDX301,GDX401)直接測(cè)定。GDX的表面積大(1～500m2/g),有一定的機(jī)械強(qiáng)度,可在250℃以下應(yīng)用。無論極性還是非極性物質(zhì),在這種固定相上的拖尾現(xiàn)象都降到限度;它和羥基的化合物親和力極小,可使水、醇類物質(zhì)大大提前流出柱子;氧化氮、HCN、NH3、SO2、COS等活潑氣體可以很快流出,不干擾測(cè)定,這些優(yōu)點(diǎn)對(duì)殘留溶劑測(cè)定來說是比較理想的。這類填料的應(yīng)用約占填充柱測(cè)定殘留溶劑的文獻(xiàn)的90%。GDX既是性能優(yōu)良的吸附劑,能直接作為氣相色譜的固定相,直接用于氣固分析,也能作為擔(dān)體涂布PEG系(PEG20M,PEG2M,PEG10000,PGE5000),DEGS(丁二酸二乙二醇酯),DG(縮二甘油),丙二醇乙二酸聚酯,OV-225,SE52(苯基甲基硅酮)等固定液,用于殘留溶劑測(cè)定,當(dāng)然擔(dān)體的選擇也有多種,如6201、硅藻土、PoraparkQ等。在柱子的選擇上,一般選用GDX系列就能解決問題,但對(duì)于某些樣品,就需要用某些固定液來進(jìn)行分離才能滿足要求,如二甲基甲酰胺26。選擇原則是相似相溶,對(duì)于醇、胺等能形成氫鍵的物質(zhì),除上面介紹的GDX外,也可選擇極性固定液。另外也可將不同極性的固定液混合涂布在擔(dān)體上進(jìn)行分離27。

　　毛細(xì)管柱的種類也很多,如OV-101,SE-54,CP-Sil-5CB28,AC-20,SE-30,HP-5,HP-20M,100%二甲基硅氧烷,AT-624,TFAP等,一般長10～30m不等。填充柱價(jià)格便宜,易得,一直占據(jù)溶劑殘留量檢測(cè)的主導(dǎo)地位,只是柱效較低,只有500～1000左右,分離復(fù)雜樣品的能力差。楊紹英、陳志華在測(cè)定心痛定中兩種殘留溶劑時(shí)就分別用兩種色譜條件,比較麻煩29。但填充柱仍然是我們的首要選擇。張?jiān)伱贰⒑殄P在紫杉醇原料藥中有機(jī)溶劑殘留量的氣相色譜分析中,應(yīng)用GDX401填充柱同時(shí)檢測(cè)甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷,方法準(zhǔn)確可靠30。王衛(wèi)、高立勤在測(cè)定鹽酸莫索尼定有機(jī)溶劑殘留量時(shí)以正丙醇為內(nèi)標(biāo),用GDX-401填充柱測(cè)定乙醚和異丙醇的殘留量,方法靈敏、準(zhǔn)確、可信31。鄧湘昱也用GDX-401填充柱測(cè)定鹽酸土霉素中殘留甲醇,結(jié)果證明方法簡單可靠32。黃劍英、顧以振用GDX-401填充柱、用恒溫條件建立同時(shí)測(cè)定中國藥典規(guī)定的7種溶劑的測(cè)定方法,方法分離度較好,準(zhǔn)確可靠33。這些均說明填充柱在測(cè)定殘留溶劑中的重要作用。近年來,毛細(xì)管柱應(yīng)用越來越多,有取而代之的趨勢(shì)。特別是近兩年,文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于殘留溶劑測(cè)定的文章中,用毛細(xì)管柱測(cè)定的約占總數(shù)的90%,填充柱只占10%,由此可見其趨勢(shì)。毛細(xì)管柱的理論塔板數(shù)約為10萬左右,與填充柱相比柱效和靈敏度均要高的多,對(duì)復(fù)雜和微量殘留溶劑的分析能力有極大的提高,所以選擇毛細(xì)管柱一般都能解決分離問題。其中柱口直徑為0153mm的大口徑毛細(xì)管柱因其柱容量大尤其應(yīng)用廣泛。姚倩、李章萬、張強(qiáng)等用幾種大口徑毛細(xì)管柱,以藥物合成中常用的16種有機(jī)溶劑為研究對(duì)象,建立檢查殘留溶劑的方法,并考察不同極性的色譜柱(HP-1,HP-5,HP-20M)及不同提取溶劑(水,DMF,DMSO)對(duì)分離與檢測(cè)的影響。在雌激素原料殘留溶劑的檢測(cè)中,除甲醇和乙醇外,其它14種溶劑均在檢出限度以下,方法簡便靈敏,準(zhǔn)確度高,說明本方法適用于常規(guī)藥物中溶劑的檢查。另外應(yīng)用毛細(xì)管柱的例子還有很多,不勝枚舉。

　　1.5柱溫的選擇

　　柱溫對(duì)分離起關(guān)鍵作用,視所測(cè)組分和所選用色譜柱而定,一般用固定溫度分析,即恒溫色譜(IGC),柱溫范圍在50～200℃左右,根據(jù)樣品與殘留溶劑的分離情況而定。對(duì)于沸程很寬、殘留溶劑種類較多的樣品可選用程序升溫的辦法(PTGC)。

　　1.6檢測(cè)器的選擇

　　一般選用FID檢測(cè)器,也有選用MS為檢測(cè)器的,多為GC-MS聯(lián)用儀。對(duì)于含氯元素的溶劑,選用ECD檢測(cè)器專屬性強(qiáng),可排除雜質(zhì)干擾。中國藥典2000年版、美國藥典24版(USPXXIV)均選用FID檢測(cè)器,英國藥典2000年版(BP2000)則上述三種檢測(cè)器均有應(yīng)用。