光學顯微鏡的出現(xiàn)及其影響

　   自荷蘭博物學家、顯微鏡創(chuàng)制者Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)在17世紀次將光線通過透鏡聚焦制成光學顯微鏡并用它觀察微生物(microorganisms or animalcule)以來，顯微鏡就一直是生物學家從事研究工作、探尋生命奧秘的利器。正是因為有了Leeuwenhoek的這項偉大發(fā)明及其后繼者對顯微鏡技術(shù)的不斷改進和發(fā)展，人們才能夠?qū)毎麅?nèi)部錯綜復雜的亞細胞器等結(jié)構(gòu)的形態(tài)有了初步的了解。

      此后，研究人員對顯微鏡技術(shù)的追求從未停歇過，他們總是希望能得到分辨率更高的顯微鏡，從而更好地觀察細胞內(nèi)部更細微的結(jié)構(gòu)。近，《自然-方法》(Nature Methods)雜志上報道的超高分辨率成像技術(shù)(super-resolution imaging, SR imaging)終于使得人們可以在單分子水平上進行觀察研究。

　　SR技術(shù)的發(fā)展過程

　　在達到今天SR技術(shù)水平的過程中，承載了許許多多研究人員辛勤勞動的汗水，也面臨著諸多亟待解決的難題。

       在以上這些光學SR成像技術(shù)中有兩種技術(shù)——受激發(fā)射減損顯微鏡(stimulated emission depletion microscopy, STED)和飽和結(jié)構(gòu)光學顯微鏡(saturated structured illumination microscopy，SSIM)。

　　近，基于探針SR成像技術(shù)的光敏定位顯微鏡(PALM)和隨機光學重建顯微鏡(STORM)，以及借助熒光基團隨機激活特性的熒光光敏定位顯微鏡(FPALM)都已經(jīng)取得了成功。

　　通過基于探針的SR成像技術(shù)，可以獲得多張原始圖像。在每一張原始圖像中，細胞內(nèi)只有一部分被熒光標記的分子能發(fā)出熒光，即這些熒光分子都處于不斷激活和滅活的交替狀態(tài)，每一次都只有部分分子能被觀察并成像。而且由于每次發(fā)出熒光的分子都分散得較為稀疏，因此相互之間不會受到影響，也就避免了因相鄰分子發(fā)出熒光而無法分辨的問題。后將這些原始圖片疊加、重合在一起就得到了終的高分辨率圖像。這樣，就能使得那些以前由于熒光點太密以至于無法成像的結(jié)構(gòu)的分辨率達到納米級水平，而且成像的分子密度也相當高，可以達到105個分子/μm2。

　　這種分辨率對于生物學家來說，意味著現(xiàn)在可以在分子水平上觀察細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)及其動態(tài)過程了。

       雖然顯微鏡技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了如此高度，但它仍然只是生物學家研究中使用的一種工具。因此還需要將顯微鏡獲得的圖像與其它的試驗結(jié)果互相參照，才能獲得準確的結(jié)果。人們需要認清SR顯微鏡的優(yōu)勢與劣勢，為操作以及判斷SR圖像制定出標準化的操作規(guī)范，只有這樣才能大限度地發(fā)揮SR顯微鏡的作用。

　　現(xiàn)在，由于人們對細胞內(nèi)各組份的組織結(jié)構(gòu)以及它們的動態(tài)變化過程都只有一個概念上的認識，因此，借助顯微鏡從納米水平上對這些結(jié)構(gòu)及過程進行真實的觀察能讓人們發(fā)現(xiàn)許多以往所不了解的東西。例如，以前人們通過電鏡發(fā)現(xiàn)細胞骨架是由大量絲狀網(wǎng)格樣組織構(gòu)成時，就有人對此現(xiàn)象持懷疑態(tài)度。那些認為細胞骨架是一種用來稀釋細胞內(nèi)生化物質(zhì)濃湯這樣一種結(jié)構(gòu)的細胞生物學家把這種觀測結(jié)果稱作僵化的人為試驗結(jié)果。

　　除非的SR顯微鏡圖像或者其它的試驗結(jié)果都能證明細胞骨架是由大量的絲狀網(wǎng)格樣組織構(gòu)成的，否則還會有人持上述的懷疑觀點。不過已經(jīng)有其它的生化試驗結(jié)果證實了早期的電鏡觀察結(jié)果是正確的。當然新興的SR技術(shù)也需要其它傳統(tǒng)的生化試驗結(jié)果予以佐證才有價值，同時還需要電鏡的輔助。因為電鏡能提供納米級的觀察結(jié)果，這對于佐證具有同樣分辨率的SR顯微鏡觀測結(jié)果來說是價值的。

　　今后，大家在逐步了解、接受和廣泛使用SR顯微鏡的同時，需要注意將會出現(xiàn)的各種問題，以下的表格列出了部分與SR顯微鏡使用相關的缺點及其目前的解決方法。

       近幾年，就如何處理圖像已經(jīng)有了非常嚴格的操作規(guī)范。不過迄今為止，對于怎么處理SR圖像還沒有一個標準的操作規(guī)范。尤其需要指出的是，PALM和STORM數(shù)據(jù)在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一張SR圖像上，分子的不確定性和密度都能用顏色表示出來，這種圖像把細胞內(nèi)該分子有可能出現(xiàn)的任何地點都標示出來了。而且只有被標記的分子按照一定的標準(發(fā)出的光子數(shù))判斷它的確是一個單分子并且定位準確之后才顯示出來。必須對獲得的圖像進行這樣的標準化處理之后才能分析結(jié)果。同樣，對于試驗數(shù)據(jù)也需要如此進行標準化處理。要提高分辨率不僅需要分子定位、分布得比較好，還需要分子數(shù)目夠多，以致能達到尼奎斯特判斷法(Nyquist criterion)的要求，即分子間的平均距離要小于顯微鏡分辨率的一半。雖然上述問題都不會影響SR顯微鏡的應用，但由于存在這些問題，所以我們應該時刻提醒自己，一定要仔細判讀、分析SR顯微鏡的圖像結(jié)果，只有這樣才能得到有價值的生物學結(jié)論。

       SR熒光顯微鏡在生物學研究中的應用

　　到目前為止，人們還很難得知，SR熒光顯微鏡會對生物學界的哪一個領域帶來重大變革，但已經(jīng)有幾個領域出現(xiàn)了明顯的改變。這些研究領域是動態(tài)及靜態(tài)的細胞組織結(jié)構(gòu)研究領域、非均質(zhì)分子組織研究領域、蛋白動態(tài)組裝研究領域等。這幾個領域都有一個共同的特點，那就是它們研究的重點都是分子間如何相互作用、組裝形成復合物。因此，能在納米水平觀察這些分子對它們來說具有重大的意義。

　　通過觀察蛋白質(zhì)之間的組合關系來了解它們的作用，并能為后續(xù)的細胞功能試驗打下基礎

　　結(jié)構(gòu)生物學研究在這方面已經(jīng)取得了很大的進展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4-8納米大小的分子間相互作用組裝成細胞微管、肌絲、中間絲這些超過10微米大小聚合物的機制。不過對于核孔復合體、中心體、著絲點、中間體、粘著斑這些由許多不同蛋白經(jīng)過復雜的三維組裝方式組合起來的復合體，還需要更好的辦法來進行研究。目標就是要達到分子水平的分辨率，這樣就可以觀察大復合體形成過程中的單個分子，也就能對這些分子的化學計量學有所了解了。要得到更多的生物學信息就需要SR顯微鏡這樣的三維成像技術(shù)，例如可以使用活體細胞SR成像捕捉細胞骨架的動態(tài)重構(gòu)過程等等。

　　SR成像有助于人們更好地了解分子間的差異

　　細胞膜蛋白組織方式的經(jīng)典模型已經(jīng)從隨機分布的液態(tài)鑲嵌模型轉(zhuǎn)變成了脂筏模型、穴樣內(nèi)陷模型或特殊蛋白模型。這種差異與細胞不同功能相關，例如在高爾基體、cargo蛋白和高爾基體酶蛋白之間必須發(fā)生相互作用，但終它們會按照各自的功能分開，發(fā)揮各自的作用。有很多試驗手段，例如免疫電鏡技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)等都已經(jīng)被用來研究這種膜不均一性問題了。多色PALM技術(shù)(Multicolor PALM)為人們提供了一種新的手段用來觀察膜蛋白集合、組織的過程，并且還能定量分析不同蛋白間的空間距離關系。因為有了PALM提供的單分子信息，人們就可以清楚地了解蛋白分子間的空間關系，甚至有可能計算出相隔某一距離的分子之間發(fā)生相互作用的可能性。這種方法除了用于研究膜蛋白之外，還能用于許多非隨機分布的生物系統(tǒng)研究，例如研究微管上的馬達蛋白。

　　SR成像技術(shù)還能用于在單分子水平研究蛋白動態(tài)組裝過程

　　細胞對外界刺激信號的反應起始于胞膜，在胞膜上受體蛋白之間發(fā)生動態(tài)的集合，用來調(diào)節(jié)細胞的反應活性。像HIV這種有被膜病毒也是在細胞膜上完成病毒顆粒組裝過程的病毒，也是利用了細胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運機制。盡管現(xiàn)在蛋白組裝的物理模型還遠遠沒有完成，但研究人員知道膜蛋白的動態(tài)組裝過程是不均一的，所以通常使用熒光試驗手段很難獲得分子水平上的信息。同樣，單分子測量技術(shù)(Single molecule measurements)也存在著類似的局限，因為單分子測量技術(shù)只能觀察細胞內(nèi)的幾個分子，所以缺乏整體的信息。因此由于缺乏空間分辨率，很難動態(tài)地研究蛋白質(zhì)組裝過程。SR熒光成像技術(shù)與活細胞成像技術(shù)和單分子示蹤技術(shù)(sptPALM)結(jié)合就能解決這一問題。我們可以借助分子密度準確地看出PALM圖像中的蛋白質(zhì)簇，蛋白質(zhì)簇動態(tài)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)和形態(tài)學數(shù)據(jù)能幫助我們了解蛋白質(zhì)動態(tài)組裝的機制。